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文献赏析

华盈视角:陈赛娟院士团队发现白血病治疗新靶点

2019/02/21

        2019年2月,华盈生物合作伙伴上海交通大学医学院血液学研究所陈赛娟院士课题组在美国科学院院报(PNAS)上(PMID:30659143)在线发表了高三尖杉酯碱治疗白血病的新机制。

 

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(HHT通过直接结合NFκB抑制因子下调MYC转录表达)

本文涉及LC-MS/MS技术和关键生物信息分析由华盈生物提供

       
        急性粒细胞白血病(AML)是一组造血系统恶性克隆性疾病,其特点是骨髓细胞分化受阻,成纤维细胞聚集。中药高三尖杉酯碱(HHT)是一种蛋白质合成抑制剂,具有抗髓性白血病的作用,尤其针对t(8;21)亚型具有良好的预后效果。HHT对AML t(8;21)亚型的选择性作用反映出其更多的抗白血病作用机制,那么,问题来了,HHT的作用机制是啥呢,该如何研究?

        本文作者通过HHT处理的t(8;21)小鼠白血病模型发现白血病发生的驱动因素MYC基因产生下调,并利用pull down实验+蛋白质谱技术找到HHT的直接结合蛋白NKRF,发现其与MYC的间接调控作用,从而揭开系列作用机制。

 

华盈视角为您倾情解读

1、HHT治疗导致MYC基因表达下调

        研究人员在RUNX1-RUNX1T1和KITN822Kmut共表达t(8;21)小鼠白血病模型中,发现HHT对中白血病起始细胞(Lin/Sca-1/c-kit+;LICs)的活性有显著的抑制作用,验证了HHT的治疗效果。

        随后,在HHT处理的Kasumi-1细胞中,通过与未经HHT处理细胞的基因表达谱比较分析,MYC的表达在HHT处理的样品中明显降低(图1A)。采用不同的HHT浓度研究了其对经典的靶向基因(包括MYC、CTNNB1和MCL1)蛋白水平和mRNA表达水平的影响,发现HHT引起MYC蛋白水平下调所需的浓度远低于CTNNB1和MCL1;CTNNB1MCL1经过HHT作用后其mRNA表达水平不下降,而MYC的mRNA表达水平明显下降(图1B)。该结果说明HHT对MYC的下调是蛋白水平与转录表达水平不同机制的共同作用,而HHT对MYC的转录下调机制就是本文的新发现

        接下来,研究人员评估了6个AML细胞系Kasumi-1, SKNO-1, NB4, HL-60, U937和 THP-1中MYC的表达,发现MYC的转录水平与这6个细胞系对HHT的敏感性相关(图1C)。结果表明,HHT可以减弱t(8;21) AML细胞中MYC基因的表达,并且下调作用可能与HHT的治疗效果相关。

 

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图1 HHT治疗导致MYC基因表达下调

 

2、HHT靶向MYC转录调节因子NKRF

        HHT是如何调节MYC的,是直接作用还是间接作用呢?研究人员用生物素标记的HHT(bio-HHT)孵育Kasumi-1细胞裂解物,然后采用华盈生物Pull-down+蛋白质谱技术检测与HHT作用的靶标蛋白。根据质谱检测结果,华盈生物同时提供关键生物信息分析,最终作者分析得到在bio-HHT组中检测到9种蛋白与MYC表达相关的差异蛋白。其中,6种位于MYC通路的下游(ABCD1, ABCD3, CLIC4, GLYR1, ASNS和ABCF3),3种位于MYC表达的上游(SRC, STAT1和 NKRF)(图2A)。根据已知研究,SRC和STAT1能够上调MYC的mRNA水平,而NKRF(NF-κB抑制因子)是一种通过抑制p65下调MYC表达的抑制剂。

        通过Streptavidin(SA)琼脂糖亲和试验WB结果表明,只有NKRF能直接与Kasumi-1细胞中的HHT相互作用(图2B)。研究人员还发现NKRF通过第二个双链RNA结合基序(DSRM2结构域)直接与HHT结合。而一系列的缺失和突变实验将HHT直接结合位点定位到DSRM2结构域的K479和C480氨基酸(图2C)。

 

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图2 HHT靶向MYC转录调节因子NKRF

 

3、HHT通过结合NKRF和激活p65信号下调MYC表达

        据报道,NKRF维持NF-κB处于非活性状态,并抑制其下游MYC表达的激活。本文研究使用TNF-α来分析p65信号激活的结果,发现在TNF-α刺激的Kasumi-1 细胞中,HHT处理通过占据DSRM2结构域将NKRF从核(包括核仁)转移到细胞质,促进p65-NKRF的相互作用,同时干扰p65-p50复合物的形成(图3A),从而减弱p65对MYC基因的激活,而不涉及p65的经典翻译后修饰(图3B)。分别用靶向NKRF的shRNA(shNKRF)和杂乱shRNA(shSCR)转染Kasumi-1和SKNO-1细胞,建立小鼠移植模型。在内源性NKRF被shRNA敲除50%后发现,敲除降低了HHT诱导的p65易位(图3C),Kasumi-1细胞中HHT在下调MYC的过程中也明显失去了作用(图3D)。

 

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图3 HHT处理后p65蛋白的激活情况

 

4、HHT对KIT表达的抑制与MYC下调相关

        据先前的研究报告,81。3%的t(8;21) AML患者可检测到KIT的过度表达。在这里,研究人员观察到37个原发性AML样本中MYC和KIT表达之间的显著相关性(图4A),特别是在t(8;21) AML患者中(图4B)。在用HHT处理24小时的Kasumi-1和Skno-1细胞中,KIT的mRNA和蛋白质水平与MYC一起下调(图4C)。通过观察发现,KIT和MYC表达的相关性进一步增强。

 

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图4 KIT和MYC表达相关性


研究路线:

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小结:

       HHT是一种经典的中药小分子,已应用于白血病治疗30多年,以往对于HHT机制的认识一般为HHT通过抑制核糖体延伸过程中的mRNA翻译起到治疗AML的作用。本文利用小分子Pull-down实验结合蛋白质谱技术筛选到HTT的直接结合NKRF蛋白(NF-κB抑制因子),并以NKRF蛋白为线索,通过深入的生信分析和文献挖掘,找到了一条全新的HHT作用机制。即HHT通过直接结合NF-κB抑制因子NKRF下调MYC转录表达,通过下调MYC转录表达抑制KIT的表达从而达到t(8;21) AML良好的治疗效果。 

        本文研究逻辑紧密,技术路线十分经典,为致力于寻找药物靶标、探索其作用机制的研究人员提供了优秀的研究范本,值得推荐。

 

英文文献链接:


蛋白质谱服务简介

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